测序分析之DEG分析方法

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热心网友 时间：1天前

DEG分析方法是测序数据解读中的关键步骤，用于识别在不同实验条件下的基因表达差异。本文旨在介绍从数据质控、读取修剪、对齐到计数及差异表达分析（DEG）的全过程，所有操作均基于Linux环境进行。

在解读测序数据前，首要步骤是进行数据质量控制，移除质量低、包含适配子的reads，以确保分析的可靠性。常用工具包括trimmomatic、trim galore、skewer、scythe & sickle等。Skewer因其速度快、可自动生成报告的优点，是个人推荐的选择。

进行读取修剪时，需准备适配子清单，通常可从Illumina官方网站获取，清单随不同测序库序列变化。在修剪后，使用fastqc检查reads是否达到质量标准，确保数据质量。

快检后，通过观察读取质量、GC含量、Overrepresented序列及适配子含量，评估数据质量。高质量数据有助于后续分析的准确性和可靠性。

尽管DEG分析更多关注基因层面的表达量，但对读取质量进行处理（如适配子移除）仍十分重要。高质量的reads有助于提高映射精度，确保在转录本层面的表达分析。

QuantSeq项目在低测序成本下提供有前景的测序方案，尤其适用于DEG分析。其测定5'或3'端序列的特点要求高读取质量，以便准确检测基因表达。

使用bowtie或hisat作为对齐工具，两者性能差异不大。在对齐过程中，无需特别调整参数，使用默认设置即可。对于stranded RNASeq，确保正确设置参数（如--rna-strandness RF 和 --fr）至关重要，以避免映射方向错误。--dta-cufflinks参数在后续分析中如有需要，应予以考虑。

映射过程完成后，从原始sam或bam文件提取正确且唯一的映射reads。这一步骤中，使用sam文件中的flag进行过滤，结合NH标识以确认reads的唯一性，可有效创建高质量的sam或bam文件。

IGV工具提供直观的sashimi图像，用于观察每个基因在不同样本中的表达量及转录本结构。这有助于深入了解基因表达情况。

计数阶段，利用featureCounts、cufflinks或htseq-count等工具对基因进行定量。其中，featureCounts提供快速、精确的计数结果，通常在几分钟内完成大量数据的计数。

正常化计数是下一步，通常通过基因长度数据计算RPKM或FPKM，或使用DESeq2提取正常化数据。具体方法可参考相关文献。

差异表达分析（DEG）通过DESeq2或edgeR等工具进行，方法简单直接，但需熟悉R语言。在进行DEG分析前，通常进行PCA分析，检查样本重复性，确保分析的可靠性和有效性。

GO富集分析在识别差异表达基因的功能上提供重要见解，使用如topGo等R工具进行，可分别对上调和下调基因进行分析，明确功能变化。

以上介绍了DEG分析的基本流程，每个步骤中可使用多种工具，如有理解或操作上的疑问，欢迎指正。

热心网友 时间：1天前

DEG分析方法是测序数据解读中的关键步骤，用于识别在不同实验条件下的基因表达差异。本文旨在介绍从数据质控、读取修剪、对齐到计数及差异表达分析（DEG）的全过程，所有操作均基于Linux环境进行。

在解读测序数据前，首要步骤是进行数据质量控制，移除质量低、包含适配子的reads，以确保分析的可靠性。常用工具包括trimmomatic、trim galore、skewer、scythe & sickle等。Skewer因其速度快、可自动生成报告的优点，是个人推荐的选择。

进行读取修剪时，需准备适配子清单，通常可从Illumina官方网站获取，清单随不同测序库序列变化。在修剪后，使用fastqc检查reads是否达到质量标准，确保数据质量。

快检后，通过观察读取质量、GC含量、Overrepresented序列及适配子含量，评估数据质量。高质量数据有助于后续分析的准确性和可靠性。

尽管DEG分析更多关注基因层面的表达量，但对读取质量进行处理（如适配子移除）仍十分重要。高质量的reads有助于提高映射精度，确保在转录本层面的表达分析。

QuantSeq项目在低测序成本下提供有前景的测序方案，尤其适用于DEG分析。其测定5'或3'端序列的特点要求高读取质量，以便准确检测基因表达。

使用bowtie或hisat作为对齐工具，两者性能差异不大。在对齐过程中，无需特别调整参数，使用默认设置即可。对于stranded RNASeq，确保正确设置参数（如--rna-strandness RF 和 --fr）至关重要，以避免映射方向错误。--dta-cufflinks参数在后续分析中如有需要，应予以考虑。

映射过程完成后，从原始sam或bam文件提取正确且唯一的映射reads。这一步骤中，使用sam文件中的flag进行过滤，结合NH标识以确认reads的唯一性，可有效创建高质量的sam或bam文件。

IGV工具提供直观的sashimi图像，用于观察每个基因在不同样本中的表达量及转录本结构。这有助于深入了解基因表达情况。

计数阶段，利用featureCounts、cufflinks或htseq-count等工具对基因进行定量。其中，featureCounts提供快速、精确的计数结果，通常在几分钟内完成大量数据的计数。

正常化计数是下一步，通常通过基因长度数据计算RPKM或FPKM，或使用DESeq2提取正常化数据。具体方法可参考相关文献。

差异表达分析（DEG）通过DESeq2或edgeR等工具进行，方法简单直接，但需熟悉R语言。在进行DEG分析前，通常进行PCA分析，检查样本重复性，确保分析的可靠性和有效性。

GO富集分析在识别差异表达基因的功能上提供重要见解，使用如topGo等R工具进行，可分别对上调和下调基因进行分析，明确功能变化。

以上介绍了DEG分析的基本流程，每个步骤中可使用多种工具，如有理解或操作上的疑问，欢迎指正。